Клинические исследования Живого Коллагена

Отчет N 034.21.085

«Анализ молекулярно-массового распределения белковых фракций в трех коллагенсодержащих образцах методом одномерного электрофореза»

Пробоподготовка

Отбирали 100 мг образца и добавляли 400 мкл лизирующего раствора (9 М мочевина, 5 % β-меркаптоэтанол, 2 % тритон Х-100, 2% амфолины с рH 3 – 10). Полученный гомогенат осветляли центрифугированием при 14000 об/мин в течение 10 минут. После чего, супернатант отделяли и добавляли к нему в соотношении 1:1 белкового буфера, для приготовления которого в пробирки типа «эппендорф» вносили 1 мл додецилсульфата натрия (SDS) 10%, 250 мкл концентрированного β-меркаптоэтанола, 625 мкл Трис-HCl 0,5 М, 1,5 г мочевины, прибавляли бромфеноловый синий до темной окраски и доводили до объема 5 мл водой, и затем прогревали пробы на кипящей водяной бане в течение 5 минут.

Одномерный электрофорез в полиакриламидном геле

Для проведения вертикального гель-электрофореза использовали камеру (Хеликон, Россия) и заполняли её 10 % полиакриламидным гелем. Поверх него заливали 6 % гель, сделав в нем лунки для внесения образцов. Каждый исследуемый образец вносили в количестве 6 мкл. В качестве буфера использовали раствор, содержащий 25 мМ трис-HCl, 192 мМ глицина и 0,1%SDS. Электрофорез осуществляли при следующих параметрах: первые 30 минут – 60 В и далее при 120 В, пока фронт красителя (бромфеноловый синий) не достигнет нижнего края гелевых пластин.

Визуализация и анализ изображений

Окрашивание белков Кумасси G-250 проводили в растворе следующего состава: 10 % уксусной кислоты, 25 % изопропанола, 0,05 % кумасси G-250. Для удаления не связавшегося красителя использовали 10 %-ную уксусную кислоту.

Для повышения разрешающей способности, дополнительно проводили окрашивание азотнокислым серебром по методике Blum’а.

Для проведения компьютерной денситометрии использовали одномерные электрофореграммы, находившиеся во влажном состоянии. Их полные цифровые изображения получали с помощью сканера Bio-5000 Plus (Serva, Германия) в режиме 600 ppi 2D-RGB. Полученные цифровые изображения редактировали в графическом редакторе.

Результаты

В результате исследования 3 образцов получены электрофореграммы в нескольких повторах.

Условные обозначения:

Ст – Стандарт молекулярных масс: 250, 150, 100, 70, 50, 40, 30 кДа (сверху вниз).

Образец 1 – Старая формула

Обнаружено большое количество интенсивно окрашенных белков с молекулярной массой более 50 кДа, наиболее выраженные фракции: 34 кДа, 43 кДа, 47 кДа, 58 кДа, 63 кДа, 70 кДа, 90 кДа и 150 кДа. В соответствии с базой данных Swiss-Prot, вероятно, являющиеся остеонектином, фибромодулином, трансформирующий бета-3 протеин фактора роста, кохлином, цепью коллагена альфа-3 (IX), коллагеновой цепью альфа-2 (IX), эластином, цепью коллагена альфа-1 (IX) и цепью коллагена альфа-1 (XVII).

Образец 2 – Улучшенная формула Первого Живого Коллагена

Обнаружено большое количество интенсивно окрашенных белков во всем диапазоне молекулярных масс, наиболее выраженные фракции: 23 кДа, 30-31 кДа, 35 кДа, 38 кДа и широкий спектр белков от 20 кДа до 270 кДа. В соответствии с базой данных Swiss-Prot, вероятно, являющиеся пептидил-пролил цис-транс-изомеразой B, коллектином-10, белком, связанным с хрящом, остеонектином, белком хрящевого матрикса, цепью коллагена альфа-3 (IX), коллагеновой цепью альфа-2 (IX), эластином, цепью коллагена альфа-1 (IX) и цепью коллагена альфа-1 (XVII).

Образец 3 – Сторонний образец

Отмечено небольшое количество слабовыраженных фракций в 44 кДа, 50 кДа, 70 кДа, 85 кДа, 110 кДа. Наиболее интенсивно окрашенные белки были обнаружены в области более 230 кДа, в соответствии с базой данных Swiss-Prot, вероятно, являющиеся альфа-текторином, цепью коллагена альфа-3 (VI), цепью коллагена альфа-1 (XII) и фибронектином.